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02第2章遗传图绘制0905共49页文档_图文

克隆(clone)定义 一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因 结构相同的细胞或个体。(组培) 基因克隆,则指一个基因反复扩增后产生的多 个拷贝。 动名词(cloning)即指获得克隆的过程或手段。 利用体外重组技术将某特定的基因或DNA序 列插入载体分子的操作过程。 1. 重叠克隆群法 构建过程: DNA测序不能从染色体进行,首先 必须克隆化。先构建片段DNA克隆(以YAC或 BAC为载体),并把克隆依染色体排序,这就是 “染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色 体上所在的位置排序,可以得到相互重叠的一系 列克隆,叫做“克隆重叠群” (contiguous series of overlapping clones, Contig)。这些重叠克隆群 之间往往是有间隙的,需通过染色体步行 (chromosome walking)的方法将这些克隆群整合 在一起。在单个的重叠群中,采用鸟枪法测序, 然后在重叠群内进行组装。这是一种由上至下 (up to down)的测序策略。 2. 鸟枪法(shotgun sequencing method)将目 的DNA随机地处理成大小不同的片段,再将这些片段 的序列连接起来的测序方法。高密度的基因组图分子标 记可以检测组装的DNA片段是否处在正确的位置,并 校正因重复顺序的干扰产生的序列误排。这是一种由下 至上(bottom to up)的测序策略。 基因组图的绘制可为基因组的全面测序提供工作框架。 由于一些分子标记同基因座位紧密连锁,同时为靶基因 的定位克隆提供了可能。根据靶基因所在基因组图中的 位置,可以尽快地获知重要基因的顺序。正是基于这些 理由,人类基因组计划最初6年的工作重心主要放在人 类基因组图绘制。 鸟枪法 (shotgun sequencing method) 2.1 遗传图与物理图 根据采取的方法不同将基因组作图分为两个范畴: ①遗传作图(genetic mapping) 采用遗传学分析方 法将基因或其他DNA顺序标定在染色体上构建连锁 图。这一方法包括杂交实验和家系分析。遗传图距 单位为厘摩(cM),每单位厘摩定义为1%交换率。 ②物理作图(physical mapping) 采用分子生物学技 术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组 实际位置。物理图的距离依作图方法而异,如辐射 杂种(radiation hybrid)作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距单位为DNA的分 子长度,即碱基对。 2.2 遗传作图标记 任何一类图谱都有可识别的标记,以便寻 找目标的方位及彼此之间的相对位置。遗 传图有特征性的位置标记用表示基因组中 特定顺序所在的位置。 2.2.1 基因标记 经典遗传学研究一种性状的遗传必需要求同一性状至少有二种不 同的存在形式或称表型。如孟德尔研究豌豆植株高与矮这种相对 性状,每个相对性状都有一个不同的等位基因(allele)控制。最初 人们识别的指令表型的基因都是通过肉眼观察辨认的,如果蝇躯 体的颜色,翅膀形状等标记都可在低倍显微镜下或直接用肉眼进 行分辨。这些研究虽然在遗传学发展的早期阶段取得了很好的结 果,但很快遗传学家即意识到可见的表型性状数目十分有限,尤 其是当多个基因影响同一性状时,遗传分析往往陷入困境。为了 使遗传图具有更强的综合性,必需发现大量易于区分的、较为单 一的性状,具有生化特征的表型具备上述要求。微生物如细菌及 酵母遗传学研究中,依赖于生化表型的分析,已将一些生化性状 基因进行作图。人类血型系列(ABO)分析,血清蛋白和免疫蛋白 (人类白细胞抗原,HLA)变异研究都是利用生化的表型。这些生 化特征较之可见表型的最大优点在于:它们属于多等位基因 (multiple alleles)。例如HLA-DRBI (human leukocyte antigensDRBI,人类白细胞抗原DRBI)基因位点有至少59个等位基因, HLA-B位点至少有60个等位基因。 2.2.2 DNA标记 虽然基因标记非常有用,但并非理想的标记。 原因之一是,高等生物如脊椎动物和显花植 物,可用作标记的基因十分有限,许多性状 都涉及多基因。此外高等生物基因组中存在 大量的基因间隔区,纯粹用基因作为标记将 在遗传图中留下大片的无标记区段。还有一 个原因是,只有部分基因其等位基因成员可 以通过常规实验予以区分,因而产生的遗传 图是不完整的,必需寻找其他更有效的标记。 基因之外的作图工具统称为DNA标记。与基 因标记一样,DNA标记也必须有等位成员。 有三种类型的DNA顺序可满足上述要求: 1. 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP) RFLP概念产生于1980年(David Bostein等),其基本设 想是,由于同源染色体同一区段DNA顺序的差异,当 用限制酶处理时,可产生长度不同的限制性片段,这 些DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离,可直接显示不同 个体同一位点DNA组成的差异(图2.2)。限制酶识别的 碱基顺序有专一性,所以用不的限制酶处理同一DNA 样品时,可以产生与之对应的不同限制性片段,可提 供大量位点多态性信息。RFLP是第一种被用于作图 研究的DNA标记,它们一般有如下特征:①处于染色 体上的位置相对固定;②同一亲本及其子代相同位点 上的多态性片段特征不变;③同一凝胶电泳可显示不 同多态性片段,具有共显性特点。 2. 简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphisrns,SSLP) SSLP产生于重复顺序的可变排列,同一位点重复顺序的重复次 数不同,表现出DNA序列的长度变化。与RFLP不同的是, SSLP具多等位性(multiallelic),每个SSLP都有多个长度不一的 变异体。有两种类型的SSLP常用于作图: 小卫星序

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