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线粒体疾病的分子生物学检验_图文

线粒体疾病的分子生物学检验
Molecular diagnosis for mitochondrial related disorders

线粒体(Mitochondrion)
1. 真核细胞中的细胞器,二分裂方式进行新陈代谢,平均寿命10天 2. 多数细胞含几个到几千个线粒体 3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA(mtDNA)
2

线粒体功能 能量代谢
ATP
Mitochondrial Disease.Chest 2001; 120:634–648
3

其他功能
? 储存钙离子 ? 调节膜电位并控制细胞程序性死亡 ? 细胞增殖与细胞代谢的调控 ? 合成胆固醇及某些血红素 ? 产热
——Wikipedia

线粒体病
Mitochondrial disorders
- ? 发现 1962 年, Lufe 等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢
率,同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常。直到1988年, Wallace 等报道了首例由线粒体 DNA突变引起的人类疾病,明确了mtDNA 突 变可引起人类疾病。

? 定义- 是遗传缺陷引起线粒体异常,致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致
的一组异质性病变,又称为线粒体细胞病。

? 发病率- 约为1:5000(约每5000人中1人发病)

Smeitink 2006

线粒体病 mitochondrial disorders
—— 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病

线粒体蛋白

16,569 bp circular double stranded (mtDNA)
20% 1,500 nuclear genes 80% ——Shoubridge, 2001; Schapira,2000

? structural protein of the OXPHOS complexes ? protein required for assembly of OXPHOS complexes ? proteins involved in mtDNA translation ? proteins involved in mtDNA maintenance ? proteins involved in mitochondrial fusion and fission
Douglas C. Wallace, 1817–1819

进一步导致线粒体功能异常:
①底物的运输缺陷; ②底物的利用缺陷; ③柠檬酸循环异常; ④氧化磷酸化脱偶联; ⑤呼吸链异常。

发病特点

遗传异质性

? 核基因突变——常染色体隐性、显性遗传或X-连锁遗传 婴幼儿起病较常见

? 线粒体基因突变——母系遗传 (突变的mtDNA在母血增加,受累及的
后代发病频率增加)
mtDNA突变与临床表型之间关系复杂,主要表现为同一种
mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型,而同一种疾病
表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导。

核基因突变
? 编码线粒体结构蛋白的核基因突变 进行性外眼肌麻痹(PEO)、线粒体神经肠胃脑肌病、 Leigh氏综合征 ? 线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变 2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白 亚单位16(MRPS16)纯合突变,导致先天畸形伴张力衰竭、 四肢水肿、肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症, 该女婴 在出生后3天死亡。

线粒体基因突变
一般特点
? 突变的影响: 引起呼吸链功能缺陷 氧化磷酸化酶异常
? 阈值效应:组织特异性 突变的 mtDNA 在复制分离时可能不均等分配
? 母系遗传:不同突变后代发病风险不同。 相比A8344G突变,携带 A3243G 突变的母
系后代更容易发病。 ? 突变分布:同质性——各器官组织分布相同
异质性——不同组织、细胞分布不同

母系遗传 (Maternal Inheritance)
11

同质性突变与异质性突变

线粒体基因 同质性(Homoplasmy)
0 或 100% 异质性(Heteroplasmy)
0-100%

核基因 纯合子(Homozygous)
0 或 100% 杂合子(Heterozygous)
50%

12

mtDNA同质性/异质性突变与阈值
13

线粒体基因突变
点突变 ? 目前已报道的mtDNA 点突变将近330种,涉及mtDNA 编码的各个基因,其中结构基因突变177种、tRNA基因突 变137种、rRNA基因突变12种、D-Loop区突变2种 ? LHON、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征、 肌阵挛癫痫、破碎红纤维病、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征 等 重排 ? 重排突变逾数百
? 遗传性痉挛性截瘫等 (http://)

线粒体疾病是复杂性疾病
遗传方式复杂
常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive) 常染色体显性遗传(Autosomal Dominant) 性连锁遗传(Sex linked) 母系遗传(Maternally inherited)
临床表型复杂
累及多系统(Multisystemic involvement) 影响几乎所有组织器官(Any organ or
tissue can be affected)
15

线粒体功能涉及众多的组织器官
16

线粒体病的共同临床特点 (高度临床变异性

婴儿期发病:



常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维、脑病和Leigh综合征。

儿童发病:

见于MELAS、MERRF、Leigh病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。
中枢神经系统损害:
共济失调、癫痫、肌张力下降、脊髓病等
周围神经损害:

交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征
视听神经损害:

视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型 听力丧失出现在KSS
肌肉病

见于线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹见于KSS和PEO

Chinnery et al. Lancet 2000

线粒体疾病的生化诊断
当患者基因变异不能被确定时,完整的生化检查可以辅助诊断。
?代谢产物分析(血液、尿液、脑脊液等) 血液可以正常,但脑脊液多异常,(动脉比静脉好);乳 酸/丙酮酸比高(>50:1)提示呼吸链受到阻断。正常不除外线 粒体疾病。
?酶测定 ? 氧化磷酸化(OXPHOS)系统的酶活性测定。(western 、比色法等)方法不稳定 ? 一般情况下,血清CK(肌酸激酶)正常或轻度升高;升高 占30%见于慢性进行性眼外肌麻痹;mtDNA丢失时非常高。
J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292

线粒体疾病的生化诊断
当患者基因变异不能被确定时,完整的生化检查可以辅助诊断。
?肌肉活检 线粒体病的肌肉病理改变特点: (1)出现线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或破碎红 纤维( RRF )为主要病理改变。 (2)上述病理改变出现的频率高。 (3)缺乏其他的肌肉病理改变。
J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292 19

儿童及成人线粒体疾病的诊断标准
主要诊断标准
A 符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现 如KSS、CPEO、 MELAS、MERRF 等; ? 多系统不明原因发病 ? 必须至少三个系统出现临床症状 ? 除先证者外,至少有一个母系家族成员有发病可能 ? 排除其它代谢和非代谢疾病 B 肌活检 在骨骼肌中存在>2%破碎样红肌纤维
(Bernier et al, 2002)(3, 5)

主要诊断标准
C 有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现: ? 50岁以下肌活检COX阴性肌纤维>2%; ? 50岁以上肌活检COX阴性肌纤维>5%; ? 任一组织中呼吸链酶活性<20%; ? 任一细胞系中呼吸链酶活性<30%; ? 多于两组织内相同呼吸链酶活性<30%;
21

次要诊断标准:
A 症状符合线粒体脑肌病的临床表现; 至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现: ①30~50岁肌活检RRF在1%~2%; ②30 岁以下肌活检出现RRF; ③电镜下见广泛线粒体异常;
B 至少一种呼吸链功能受抑制的表现: ①生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20%~30%; ②用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少;
(Bernier et al, 2002)(3, 5)

次要诊断标准:
C 发现可能相关的mtDNA 异常;
D 一种或多种氧化磷酸化受损的表现: ①脑脊液或血中乳酸、丙酮酸和(或)丙氨酸增高; ②若疑为KSS,脑脊液蛋白质增高; ③PET或31P-MRS证实肌肉或脑代谢降低; ④最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈值降低。
(Bernier et al, 2002)(3, 5)

符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要 诊断指标的即为确诊线粒体病; 符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要 诊断指标的为拟诊线粒体病; 符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1 个次要诊断指标的为疑诊线粒体病。
J inherit Metab Dis.2011 April;34(2):283-292

线粒体病诊断时应注意
? 基因诊断与生化检查如能量代谢情况、呼吸链和酶复合体活 性等相结合 ? 要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变 ? 线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系 ? 散发与遗传的相关性 ,诊断是否遗传需排除环境、药物和 衰老等因素

第一节 线粒体基因组与疾病
线粒体基因组及其表达系统 线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 线粒体基因组变异与疾病
26

线粒体基因组及其表达系统
? 基因组小, 仅16569 bp

人类线粒体基因组

? 双链环状DNA

? 13 结构基因 / mRNA

? 22 tRNA 基因

? 2 rRNA 基因

? 12S rRNA 基因

? 16S rRNA 基因

? 非编码区

? D-loop(约1120bp)

? L链复制起始区(约

30~50bp,tRNAAsn-

tRNACys)

? 高突变率

Light strand: 8 tRNA and 1 mRNA (ND6) Heavy strand: 14 tRNA, 2 rRNA, and 12 mRNA Polycistronic with posttranscriptional processin27g

Complex Enzyme

I
NADH-CoQ Reductase

Inhibitor

Rotenone Amytal

Nuclear DNA Subunits

39

Mitochondrial

7

DNA Subunits ND1-6, ND4L

II

III

Succinate-CoQ CoQ-Cytochrome C

Reductase

Reductase

TTFA malonate

Antimycin A

IV
Cytochrome C Oxidase
Cyanide Carbon Monoxide
Azide

V ATP Synthase
Oligomycin

4

10

10

~14

0

1 Cytochrome b

3

2

Cytochrome oxidase ATPase 6

I , II , III

ATPase 8

The two strands of mtDNA are differentiated by their nucleotide content with the guanine rich strand referred to as the heavy strand, and the cytosine rich strand referred to as the light strand.
The heavy strand encodes 28 genes, and the light strand encodes 9 genes for a total of 37 genes. Of the 37 genes, 13 are for proteins (polypeptides), 22 are for transfer RNA (tRNA) and two are for the small and large subunits of ribosomal RNA (rRNA).

Transport chain (13 peptides) Many of the genes encode the transport chain:

Category

Genes

NADH dehydrogenase (complex I)

MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6

Coenzyme Q cytochrome c reductase/Cytochrome b (complex III)

MT-CYB

cytochrome c oxidase (complex IV)

MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3

ATP synthase

MT-ATP6, MT-ATP8

2 rRNAs
Mitochondrial rRNA is encoded by MT-RNR1 (12S rRNA) MT-RNR2 (16S rRNA).

22 tRNAs The following genes encode tRNA:

Amino Acid Alanine

3-Letter Ala

1-Letter A

MT DNA MT-TA

Arginine

Arg

R

Asparagine

Asn

N

Aspartic acid

Asp

D

Cysteine

Cys

C

Glutamic acid

Glu

E

Glutamine

Gln

Q

Glycine

Gly

G

Histidine

His

H

Isoleucine

Ile

I

Leucine

Leu

L

Lysine

Lys

K

Methionine

Met

M

Phenylalanine

Phe

F

Proline

Pro

P

Serine

Ser

S

Threonine

Thr

T

Tryptophan

Trp

W

Tyrosine

Tyr

Y

Valine

Val

V

MT-TR MT-TN MT-TD MT-TC MT-TE MT-TQ MT-TG MT-TH MT-TI MT-TL1, MT-TL2 MT-TK MT-TM MT-TF MT-TP MT-TS1, MT-TS2 MT-TT MT-TW MT-TY MT-TV

576

340

73

HV2

16365 16024
HV1

Control region

D-loop

Replication

Transcription
Human mitochondrial DNA (mtDNA) has three
promoters, H1, H2, and L (heavy strand 1, heavy strand
2, and light strand promoters). The H1 promoter transcribes the entire heavy strand and The L promoter transcribes the entire light strand. The H2 promoter causes the transcription of the two mitochondrial rRNA molecules.

The process of transcription initiation in mitochondria involves three types of proteins:
1. the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), 2. mitochondrial transcription factor A (TFAM), 3. mitochondrial transcription factors B1 and B2
(TFB1M, TFB2M).

condon

Anti-condon Nuclear tRNA Mt-tRNA

GCU GCC GCA GCG

GGC UGC

UGC

第一节 线粒体基因组与疾病
线粒体基因组及其表达系统 线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 线粒体基因组变异与疾病
43

核基因组与线粒体基因组的相互作用

核基因组编码了1500多个 线粒体蛋白

线粒体基因组只编码了13条 多肽链

“交叉对话(cross-talk)”机制
44

第一节 线粒体基因组与疾病
线粒体基因组及其表达系统 线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系 线粒体基因组变异与疾病
线粒体基因组变异
碱基突变:点突变。其中结构基因的点突变,与核基 因组一样,包括同义突变和错义突变
缺失与插入: mtDNA拷贝数目突变:
线粒体基因组变异与疾病
耳聋,Leber遗传性视神经病变,糖尿病,高血压, 肿瘤
45

在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变
MELAS综合征(线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作): A3243G (80%), T3271C(在tRNA Leu(UUR)基因)
MERRF(肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维): A8344G (80%), T8356C(在tRNALys基因)
Leber视神经病(LHON): G11778A(在ND4基因),G3460A(在ND1基因)
耳聋(Deafness): A1555G, T1494C(在12S rRNA基因) A3243G(在tRNALeu(UUR)基因)
2型糖尿病(Type 2 Diabetes): A3243G(在tRNALeu(UUR)基因)
NARP(共济失调伴色素性视网膜炎神经病): T8993G, T8993C(在ATPase 6 基因)
46

线粒体病的分子诊断
标本选择: ? 外周血白细胞——最常用 ? 毛发 ? 唾液 ? 尿液 ? 骨骼肌——检测 mtDNA分子诊断的最好标本

检测已知DNA突变的方法:

等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)

等位基因特异性扩增(ASA)

限制性片段长度多态性分析(PCR-RLFP)



连接酶链反应(LCR)



基因芯片技术





检测未知DNA突变的方法:



单链构象多态性(PCR-SSCP)



变性梯度凝胶电泳(DEEG)

异源双链分析(HA)

DNA序列测序

变性高效液相色谱(DHPLC)

线粒体疾病中常见的突变
核基因突变(nuclear gene mutations)
氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质, 例如: Surf1, SCO2, NDUFV1, NDUFS1,etc.
呼吸链缺陷: 重复、缺失
线粒体DNA点突变(mtDNA point mutations)
LHON, MELAS, MERRF, NARP, etc.
mtDNA缺失/重复(mtDNA Deletions/duplications)
eg. KSS, Pearson synd, diabetes & deafness
未知遗传(unknown inheritance)
49

第二节 线粒体基因组与耳聋
与耳聋相关的mtDNA突变 耳聋相关的mtDNA突变的检测
50

“千手观音” 21位聋哑演员中 18人有药物史
部分患者使用正常 剂量也会致聋
“一针致聋”现象

突变位点

基因

T961delT+C(n)ins 961insC

12S rRNA

T1095C

12S rRNA

C1494T*

12S rRNA

A1555G* G1606A

12S rRNA tRNAVal

同质性/异质性

疾病

同质性

药物性耳聋/ 非综合征型耳聋

同质性/异质性

药物性耳聋/ 非综合征型耳聋

同质性

药物性耳聋/ 非综合征型耳聋

同质性/异质性

药物性耳聋/ 非综合征型耳聋

异质性

综合征型耳聋

A3243G*

tRNALeu(UUR)

异质性

综合征型耳聋

G7444A
A7445G* 7472insC* T7511C*

CO1/ tRNASer(UCN) 同质性/异质性

CO1/ tRNASer(UCN) 同质性/异质性

tRNASer(UCN)

同质性/异质性

tRNASer(UCN)

同质性/异质性

药物性耳聋/ 非综合征型耳聋
非综合征型耳聋
综合征型耳聋 非综合征型耳聋

T7512C

tRNASer(UCN)

同质性/异质性 综合征型耳聋

A8344G*

tRNALys

异质性

综合征型耳聋

G8363A

tRNALys

异质性

综合征型耳聋

T14709C G15927A

tRNAGlu tRNAThr

同质性 同质性

综合征型耳聋 药物性耳聋/ 非综合征型耳聋

首次报道a
Bacino et al.(1995) Tang et al.(2002) Thyagarajan et al. (2000)
Zhao et al.(2004)
Prezant et al.(1993)
Tiranti et al.(1998) van den Ouweland, et al.(1992)
Pandya et al.(1999)
Reid et al.(1994) Tiranti et al.(1995) Sue et al.(1999) Nakamura et al. (1995) Shoffner et al. (1990) Santorelli et al. (1996) Rigoli et al.(2001)
Wang et al.(2008)

第二节 线粒体基因组与耳聋

与耳聋相关的mtDNA突变 耳聋相关的mtDNA突变的检测
PCR-RFLP技术

检测位点 A1555G C1494T
A7445G

引物序列(5′~3′) CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA ACG CCA AAA TCC ATT TCA CT CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT

退火温度(℃)
58 58

产物长度(bp)
802 987

DHPLC技术 DNA测序技术 基因芯片技术
53

对1642 例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋 汉族聋儿进行线粒体 12S rRNA 变异检测
J. Lu et al. / Mitochondrion.2010,10(4):380–390
54

55

12S rRNA 基因中有 68 个核 苷酸变异
所有的核苷酸变异均为同质 性
68 个核苷酸变异中,有 3 个 C1494T
其余 65 个变异为 A1555G
56

57

58

第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变
与 Leber 遗传性视神经病变相关的 mtDNA 突变 Leber 遗传性视神经病变相关的 mtDNA 突变常用
检测技术
59

Leber’s Hereditary Optic Neuropathy (LHON)

Normal

Acute stage

Progressive stage

Atrophy stage

Leber’s
Hereditary – inherited from mitochondrial DNA
– Optic affects the eye – Neuropathy disease/abnormality of nervous
system

Degeneration of retinal ganglion cells and their axons
Inherited from maternal mitochondrial DNA
Occurs during young adulthood

Signs and Symptoms
?Asymptomatic until visual blurring develops
Acute Phase: Painless, acute onset of central vision loss Loss of visual acuity/colour once symptoms appear in one eye, other
eye affected weeks later
Sub acute Phase ? atrophy of optic disc ? legally blind

Genetics of LHON
Maternal inheritance
Mutation occurs in mitochondrial DNA (mtDNA)
Only the egg contributes mtDNA to the embryo

Single Point Mutations 3 major pathogenic mutations:
(1) G11778A: 50-60% LHON population
(2) G3460A: 8-25% LHON population
(3) T14484C: 10% LHON population

G14459A T14484C

Males vs. Females
LHON is predominant in males
Studies looking at xlinkage have not been confirmed nor statistically significant

Epidemiology – race dependent

11778 3460 14484

70% Europeans 90% Asians
Koreans
86% Quebec Canadians Due to Founder Effect
(奠基者效应)

Heteroplasmy
presence of mixture of more than one type of organellar genome ie mtDNA
Numerous cell divisions and thus lots of time is required for mutant alleles to be expressed in mitochondria
Symptoms don’t appear until adulthood
Also implicated as the reason for variability in severity of vision loss

Retina
Photoreceptors Interneurons RGC (retinal
ganglial cells)
Neurons Axons make up optic
nerve

RGC: neurons
Fire action potentials Huge ATP demand Very sensitive to
energy supply and mitochondria defects
Especially RGCs for central visual field
Limited regeneration abilities

All Neurons are Vulnerable
Other neurons in the body can be affected too (CNS + PNS)
This results in Leber`s Plus ?Movement disorders ?Tremors ?Cardiac conduction defects ?MS-like(多发性硬化样) features

RGC ATP Demand
Oxidative Phosphorylation e- Transport Chain
ROS
Reactive O2 Species
Oxidative stress

Leber

Complex 1 aka. NADH Dehydrogenase
Intermembrane Space
4e- + 4H+ + O2 2H2O
Mitochondrial Matrix
3 point mutations e- prematurely leak to O2
e- + O2 O2-

RGC

ATP Demand

Less ATP

Oxidative Phosphorylation e- transport chain
ROS
Reactive O2 Species
Oxidative stress

Leber
More Superoxide
O2-

Things go wrong…
Leber: oxidative stress + ATP deprivation Atrophy: wearing away of tissue Chronic oxidative stress: Apoptosis (cell
death)
The link is important!!

Genetic Testing for the maternally inherited mitochondrial DNA.
Avoid potential environmental precipitants such as tobacco and excessive alcohol.
Avoid medications which have been shown to induce the disease (Ethambutol乙胺丁醇, Chloramphenicol氯霉素)

Vision damage from degeneration of optic nerve
Maternally inherited through mtDNA 3 point mutations
Complex I ROS (reactive oxygen species)
Treatment Antioxidants Inhibit mitochondrial-dependent apoptosis

与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变

原发性突变:G3460A 突变位点 基因 同质性/异质性

首次报道*

, G11778A, T14484C的突变,占 全部LHON的 80-90%

G3316A T3394C G3460A* C3497T

ND1

同质性

Saillard et al.(2000)

ND1

同质性

Hofmann et al.(1997)

ND1

同质性/异质性 Huoponen et al.(1991)

ND1

同质性

Kong et al.(2003)

继发性突变:T3394C G3733A

ND1

同质性/异质性 Valentino et al.(2004)

,T4216C ,C4019T C4171A

ND1

同质性/异质性 Kim et al.(2002)

,G5244A ,C4777T T4216C

ND1

同质性

Torroni et al.(1994)

,G9438A , G13708A ,G15257A 新突变: A4435G
位于tRNAMet 基

A4435G G7444A T10663C G11696A G11778A*

tRNAMet COⅠ ND ND4 ND4

同质性 同质性 同质性 同质性/异质性 同质性/异质性

Herrnstadt et al.(2002) Huoponen et al.(1993) Brown et al.(1995) Zhou et al.(2006) Wallace et al.(1988)



T12338C

ND4

同质性

Wong et al.(2002)

可以调节ND4

G14459A

ND6

G11778A 突变的 C14482G/A ND6

外显率

T14484C* ND6

A14495G

ND6

同质性/异质性 同质性/异质性 同质性/异质性 异质性

Jun et al.(1994) Howell et al.(1998) Johns et al.(1992) Chinnery et al.(2001)

T14502C

ND6

同质性

Ozawa et al.(1991)

C14568T

ND6

同质性

Wissinger et al.(1997)

A14693G

tRNAGlu 同质性/异质性

Tzen et al.(2003)

A15951G

tRNAThr 同质性

Li et al.(2006)

79

A4435G可以调节ND4 G11778A 突变的外显率
tRNAMet
80

第三节 线粒体与Leber遗传性视神经病变
与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变 Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技术
PCR-RFLP技术 PCR-SSCP技术 DHPLC技术 DNA测序技术 G3460A, G11778A,T11484C原发性突变测序图
81

第四节 线粒体与糖尿病
线粒体糖尿病
美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新 的糖尿病分型标准,将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特 殊类型糖尿病,属于β细胞功能遗传缺陷型糖尿病,约 占糖尿病总数的1~3%
据浙江省糖尿病防治中心提供的数据,浙江省糖尿病患 病率为2.96%
线粒体DNA突变与糖尿病 线粒体糖尿病的检验诊断
82

第四节 线粒体与糖尿病
线粒体糖尿病 线粒体DNA突变与糖尿病 线粒体糖尿病的检验诊断
83

线粒体DNA突变与糖尿病

突变位点 累及基因

C1310T A1438G

12S rRNA 12S rRNA

同质性/异质性

疾病

同质性

糖尿病临床表型

同质性

糖尿病临床表型

首次报道
Guan et al. (2010) Vawter et al.(2009)

A3243G* tRNA Leu (UUR) 异质性

糖尿病合并耳聋

Van den et al.(1992)

C3254A

tRNA Leu (UUR) 异质性

妊娠糖尿病

Ng et al. (2000)

T3264C

tRNA Leu (UUR) 异质性

糖尿病

Matsuoka et al.(1997)

T3271C G3316A T3394C T3398C A3399T T4291C A4833G

tRNA Leu (UUR) MT-ND1 MT-ND1 MT-ND1 MT-ND1 tRNA Ile MT-ND2

异质性 同质性 同质性 同质性 同质性 同质性 同质性

糖尿病 非胰岛素依赖性糖尿病 非胰岛素依赖性糖尿病 糖尿病合并耳聋 妊娠糖尿病 糖尿病临床表型 非胰岛素依赖性糖尿病

Jaksch et al. (1995) Ogihara et al. (1995) Wallace et al. (1995) Jaksch et al. (1995) Ng et al.(2000) Lifton et al. (2004) Onaya et al. (2000)

A7472C

tRNA Ser (UCN) 同质性

糖尿病合并耳聋

Hanna et al. (2005)

A8296G A10398G A12026G

tRNA Lys MT-ND3 MT-ND4

同质性/异质性 同质性
同质性

糖尿病合并耳聋
2型糖尿病 糖尿病

Ohsawa et al. (1998) Kato et al. (2003) Onaya et al. (1998)

C12258A tRNA Ser (AGY) 异质性

糖尿病合并耳聋

Turnbull et al. (1998)

T14709C* tRNA Glu T16189C MT-DLOOP

同质性/异质性 同质性

糖尿病合并耳聋 2型糖尿病

Moraes et al. (1995) Poulton et al. (1998)
84

携带tRNA Leu(UUR) A3243G突变的糖尿病家系
85

A3243G 为异质性突变

DNA Sequencing

M Un-cut 143B 43B 1

2 399bp 307bp

Control A3243G

92bp
RFLP
A3242G WT
DHPLC
86

携带tRNAGly T10003C突变的糖尿病家系
87

T10003C为同质性突变
tRNAGly
88

A
tRNAGly/tRNAs tRNAThr/tRNAs
89

Secondary structure of tRNAGly
Secondary structure of tRNALeu(UUR)
90

91

第四节 线粒体与糖尿病
线粒体糖尿病 线粒体DNA突变与糖尿病 线粒体糖尿病的检验诊断
PCR技术
正向引物(F):5′-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3′ 反向引物(R):5′-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3′ 扩增片段398 bp(3153~3551bp)
DHPLC技术 PCR-RFLP技术 DNA测序技术
92

实例 分子诊断研究 (A3243G异质性分析)

PCR-RFLP 收



PCR扩增目的片段



RT-ARMs-qPCR

人 抽提DNA



测序验证

(amplification refractory mutation system)





Pyrosequencing

(焦磷酸测序)

High-throughput sequencing
Targeted Next-Generation Sequencing 二代测序

MIDD 母系遗传性糖尿病伴耳聋 (maternally inherited diabetes and deafness):
母系遗传糖尿病家系
注:母系成员共24人,其中糖尿病患者为10人。
相应PCR产物经普通测序验证:

PCR-RFLP
mtDNA 3243 异质性突变检测结果

限制酶ApaⅠ的酶切位点 (GGGCC↓C), 由于该突变为 异质性突变, 故应该会出现 553、423、130 bp 共3 条条 带; 而野生型没有ApaⅠ的酶 切位点, 故电泳只能看到长度 为553 bp的1 条片段

图 含mtDNA 3243 PCR产物的限制性内切酶(ApaI)酶切结果图
M:DNA marker; Lane 1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17:mtDNA 3243 异质性突变; Lane 4、5、14、15:mtDNA 3243 未突变;

Targeted Next-Generation Sequencing

引物
(3组)

可以覆盖整个线粒体DNA基因组

PCR产物 富集过程

基因组DNA文库
探针
高通量捕获测序

应用技术平台 Illumina GAllX
作为新一代分子生物学综合 技 术 平 台 , Genome Analyzer测序技术避免了像传 统测序技术那样耗费大量人力 、物力进行片段克隆、转化、 质粒抽提等工作,具有高准确 性,高通量,高灵敏度,低运 行成本等突出优势,是目前市 场占有率最高的第二代高通量 基因测序仪。

Next Generation Sequencing (NGS)
测序深度(deep): 是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设 一个基因大小为2M,测序深度为10X,那么获得的总数据 量为20M。

Next Generation Sequencing (NGS)
覆盖度(coverage): 指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中
的高GC、重复序列等复杂结构的存在,测序最终拼接组装 获得的序列往往无法覆盖有所的区域,这部分没有获得的 区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序,覆盖度是98% ,那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 Read :高通量测序平台产生的序列标签

线粒体DNA序 列:16.6kb

3243位点 捕获到两种碱基A/G
support=6758(A)/903(G)
heteroplasmy mutant=11%

结果分析

高通量捕获测序检测结果:
表 MIDD家系A3243G突变异质性水平检测结果

Pyrosequencing

Step1 and Step2:

Step3 and Step4;

硫酸化酶

Step5:

荧光素酶 双峰
DNA聚合酶
双磷酸酶
PyrosequencingTM焦磷酸测序技术是一种基于四种酶(DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶 和双磷酸酶)的级联反应来进行定量序列分析的技术。在整个反应体系中,以PCR产物的一 条单链为模板,与测序引物退火结合后,按照事先计算好的顺序将四种dNTP依次加到样品中。

焦磷酸测序Qiagen PyroMark Q24

QIAGEN公司最新的PyroMark Q24 焦磷酸测序仪,采用成熟的焦磷酸测 序技术,是集测序、样品制备、试剂 和对照以及完整和灵活的软件于一体 的系统。

? 不需要制胶,不需要毛细管,也不需要荧光染料和同位素。

? 10分钟可分析96个样品的SNP,可满足高通量分析的要求;

? 每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析,实验设计灵活。

? 序列分析简单,结果准确可靠。

特点

焦磷酸测序结果:

表 MIDD家系A3243G突变异质性水平检测结果
MIDD家系A3243G突变异质性水平检测值(%)

焦 II6

II8

II10 II11 III1

III10 III12 III13 III15 III16 III17 III19 III20 IV1 IV2 IV6





测 14.2 15.2 16.2 -

-

11.2 24.9 20.5 20.5 30.6 32.9 38.9 28.3 -

-

54.7



RT-ARMs-qPCR

编号

野生型

mtDNA A3243G 突变型

II6

2.13E+06

3.60E+05

II8 II10 II11 III1 III10 III12 III13 III15

2.24E+06 2.04E+06 9.27E+05 1.40E+05 1.44E+06 1.83E+06 1.57E+06 1.66E+06

2.87E+05 4.67E+05 2.44E+02 3.08E+01 1.64E+05 4.91E+05 3.51E+05 3.94E+05

III16

1.76E+06

8.98E+05

III19 III20 Ⅳ1 Ⅳ2 Ⅳ6 Ⅳ7

1.34E+06 1.60E+06 2.66E+04 5.59E+05 6.16E+05 1.58E+06

7.11E+05 1.06E+06 6.62E+00 2.33E+02 1.29E+06 2.05E+06

突变负荷=突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)

异质突变水平(%)
14.46 11.36 18.63 0.00 0.00 10.22 21.15 18.27 19.18 33.45 34.67 39.85 0.00 0.00 67.68 56.47

精确定量A3243G 异质水平同时计 算拷贝数。
A3243G突变携 带者线粒体拷 贝与正常人拷 贝数相比较是 减少的,且其 差异有统计学 意义。

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